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李曼大会浅析

更新日期:2019年11月28日 大字 小字
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sis Enhancer 溶液至样品中,65 ℃孵育10 min。

3.剧烈涡旋震荡10min。

(此步骤可选用研磨仪,频率:6.5 m/sec ,处理时间:30S,10个循环)



4.14000 rpm离心5 min,转移上清400 μl到新的1.5 ml的离心管中。

(注意:离心后上清表面可能出现一层杂质,避免吸取这些杂质,因为这些杂质会影响下游的扩增

5.加入250 μl S3-Cleanup Buffer,立即彻底混匀。

6.14000 rpm离心2 min,转移全部上清液(约500 μl)到 预分装板的孔1、7中。

打开核酸自动提取仪,选择编辑程序并命名“environmental samples”,按照下表进行编辑。

7. 插入磁棒套,运行编辑好的程序,25min左右程序结束,转移洗脱孔6、12中的DNA至新的离心管-20℃保存或直接进入q-PCR 检测。


q-PCR检测 


1、非洲猪瘟扩增反应液的配制

取出PCR反应液,室温融化后,取相应份数(反应液20μl/T、Taq 酶0.2μl/T)混匀,然后向各PCR反应管按20μl分装;再分别加入 5μl抽提好的DNA模板或阴/阳性对照,盖好管盖;将反应管置于 全自动荧光PCR检测仪中,参照仪器操作说明设定阴/阳性对照、 待检样本参数进行PCR反应,记录好样本摆放顺序。反应体系如下表:


2、 Q-PCR仪的设置反应程序设定

第一步: 94 °C15分钟;第二步:95 °C10 秒,55 °C 35 秒,45 个循环; 荧光素设定为FAM在反应程序的第二步55°C末读取荧光值。


 阴阳性判断:


超宽线性范围,扩增检测单拷贝,超高灵敏度